TRANSFERENCIA DE EMBRIONES









jueves, 10 de diciembre de 2009

Transferencia de Embriones

Transferencia de Embriones


El trasplante de embriones es un método de reproducción artificial basado en la transferencia de embriones producidos por una hembra donante (madre genética superior) a hembras receptoras (madres portadoras) que lo gestan hasta su nacimiento. La producción de embriones ha sido propuesta como una metodología tendiente a la preservación de especies en peligro de extinción, que brinda la posibilidad de disponer de bancos genéticos para su conservación y un reaseguro sanitario para evitar la transmisión de enfermedades. A su vez, el incremento en la eficiencia de la producción y congelamiento de embriones podrá ser utilizado para constituir rebaños con el mínimo riesgo de ser portadores de enfermedades y permitir una amplia difusión mundial de animales con alto mérito genético.

se practico a una vaca, estimulando hasta lograr una ovulacion multiple mediante una diversidad de procesos que incluye  esta tecnologia de reproduccion animal, posteriormente se se realizo el traslado de los embriones a las vacas receptoras (6 vacas)  que cumplen condiciones aptas para reproducir, 




Los tratamientos hormonales para inducir la ovulación múltiple (OM) y la transferencia de embriones (TE) permiten utilizar de manera intensiva a las hembras genéticamente superiores, en forma similar al aprovechamiento que se realiza con los machos por medio de la inseminación artificial. Sin embargo, la TE en ovinos, debido a su alto costo, se encuentra limitada en su implementación. Por lo tanto, es necesario lograr maximizar la producción y sobrevivencia de los embriones, y reducir los costos en la obtención de varias crías de importante valor genético.

En la actualidad, las investigaciones están orientadas al estudio en la reducción de la alta variabilidad reproductiva de la TE, especialmente, en lo que se refiere a la respuesta individual a los tratamientos para la OM, fertilización, factores embrionarios y maternos de las ovejas receptoras.

¿Qué es la ovulación múltiple y la transferencia de embriones?

En  rumiantes y pequeños rumiantes, esta técnica usualmente incluye la administración de un tratamiento hormonal que permite aumentar el número de ovulaciones (tratamiento superovulatorio), fecundación y la obtención de varios embriones generados por una hembra donante, los cuales serán luego inoculados en hembras receptoras.


¿Qué es la ovulación múltiple y la transferencia de embriones?
En pequeños rumiantes, esta técnica usualmente incluye la administración de un tratamiento hormonal que permite aumentar el número de ovulaciones (tratamiento superovulatorio), fecundación y la obtención de varios embriones generados por una hembra donante, los cuales serán luego inoculados en hembras receptoras.
Técnica para la obtención, recuperación y transferencia del embrión
La técnica consta de varios pasos:
Sincronización de celo
El celo ovino se puede sincronizar farmacológicamente con el uso de hormonas como la prostaglandinas, PGF2α, o de dispositivos intravaginales impregnados con progesterona.
Se han utilizado esponjas intravaginales conteniendo 40 mg de Acetato de Fluorogestona, con un recambio de esponja a los 8 días (Gonzalez-Bulnez, 2005) (Figuras 1, 2 y 3). A los 4 días del recambio se coloca PGF2α y hormona Folículo Estimulante (FSH) (Gonzalez-Bulnez et al., 2004).
Figura 1. El operador mantiene en su mano el dispositivo para colocar la esponja.




Figura 2. Introducción del dispositivo en la vagina de la oveja.



Figura 3. Introducción de la esponja intravaginal.


Tratamiento Superovulatorio

Después, se continúa con un protocolo de aplicaciones de FSH cada 12 horas. Es importante señalar, que la manera como se administra el tratamiento superovulatorio tiene una gran influencia sobre la respuesta ovárica. El uso de dosis decrecientes de hormona FSH parece dar los mejores resultados, en términos de tasa de ovulación y número de embriones recuperados viables, comparado con el protocolo de dosis constantes (González-Bulnez et al., 2004)
Fecundación
Una vez realizado el tratamiento hormonal superovulatorio, se debe fecundar las células obtenidas (ovocitos). Podemos utilizar el servicio de monta natural o la inseminación artificial (IA) con semen fresco, refrigerado o congelado. Es importante recordar que bien sea el semen o los machos a utilizar, estos deben ser de alto valor genético.
Según Veiga-López (2005), el servicio o monta natural, brinda los mejores resultados en cuanto a índices de preñez obtenidos. El servicio natural debe realizarse cada 12 horas, desde el comienzo del celo hasta la finalización (Gibbons y Cueto, 1995).
Por otro lado, la IA consiste de un conjunto de operaciones y técnicas aplicadas por el hombre con el fin de conseguir la fecundación de la hembra sin la intervención directa del macho. Se debe prestar particular atención a la IA en la oveja ya que hay que considerar varios factores que interfieren con la fertilidad en esta especie.
Así, debemos considerar por un lado los factores dependientes de la hembra como es el propio manejo, la especial configuración del cuello uterino, la necesidad del empleo previo a la inseminación de las técnicas de inducción y sincronización del estro.
En el otro grupo de factores, que limitan la eficacia de la inseminación artificial ovina, involucran al macho, a través de su producción seminal y al igual que en la hembra incluyen el manejo y selección de los animales, la diversidad de características seminales de los individuos e inclusive las variaciones entre eyaculados del mismo animal y de los procesos de dilución-conservación tanto del semen fresco como del congelado.
La técnica de inseminación puede hacerse con deposición cervical del semen, a la entrada del cérvix, para lo cual el técnico se ayuda con un espéculo y una fuente de luz. Por lo general, los índices de fertilidad obtenidos a través de esta técnica son muy bajos.
Se han descrito otras técnicas de IA (transcervical) en la cual, por medio de una pipeta especial de inseminación y un fórceps se intenta atravesar el tortuoso cuello uterino de la oveja para llegar al útero. Esta técnica es dificultosa y, por lo regular, no se llegan a penetrar la totalidad de los animales. La fertilidad obtenida fluctúa entre 51 y 68%. La causa de esta baja tasa de fertilidad y preñez se la asigna al trauma cervical y uterino después de la manipulación (Steelflug et al. 2001)
La técnica de inseminación intrauterina, implica la deposición del semen directamente en los cuernos uterinos por medio de una laparotomía medio-ventral o con la ayuda de un laparoscopio.
Gibbons y Cueto (1995) recomiendan el uso de la técnica laparoscópica en caso de recurrir a la IA, ya que la deposición del semen en los cuernos uterinos, próximos al sitio de fertilización, aumentan las tasas de fertilidad y reducen las dosis de inseminación. La inseminación intrauterina se debe realizar entre las 51 a 53 horas después de retiradas las esponjas intravaginales (González-Bulnez, 2005).
En general, los animales deben mantenerse en una dieta sólida y líquida durante las 24 horas previas a la inseminación para evitar punciones accidentales en el rúmen o en la vejiga urinaria. Las ovejas son colocados en camillas pivotantes con un sistema que permite inmovilizar a la oveja en decúbito dorsal e inclinarla hasta un ángulo de unos 40-45° de tal forma que las vísceras se desplacen en sentido craneal (Figura 4).
Una vez sujeto el animal, se depila la zona craneal a la ubre y se desinfecta con una solución yodada.
Para realizar la IA por endoscopía, se requiere de un laparoscopio rígido de 7 mm de diámetro, conectado a una fuente de luz mediante un cable de fibra óptica y dos cánulas con trócar. También se requiere de un aplicador-palpador y una pipeta de inseminación.
Una vez inmovilizada la oveja en la camilla, se realiza la primera punción con el trócar (7 mm) unos 2-3 cm por delante de la ubre y 2-3 cm a la derecha de la línea media. Se introduce el laparoscopio y se insufla gas para distender las vísceras abdominales contra la cara peritoneal y poder realizar fácilmente la inspección del aparato genital. Luego se introduce el segundo trócar (5 mm) en el lado izquierdo (Figura 5).
Figura 4. Oveja sujeta a camilla e inclinada en el ángulo correcto.



Figura 5. Colocación de los trócares. 



A través de el segundo trocar, se introduce el aplicador-palpador con el cual se localiza el útero y se realiza la punción de la pared, a la altura de la curvatura mayor de cada uno de los cuernos, depositándose la mitad de la dosis en cada uno de ellos.
Tras la intervención se retiran las cánulas y se aplica una solución desinfectante en la zona de intervención, generalmente no es necesario realizar sutura (Figuras 6 y 7). Se han reportado porcentajes de fertilidad con la IA intrauterina oscila entre 58,7% y 80%.
Figura 6. Pipeta de inseminación colocada en la cánula.



Figura 7. Manipulación para realizar la inseminación en la curvatura mayor del cuerno.



Recuperación de embriones
Una vez transcurridos 5 a 7 días de presentado el celo, o 5 días después de realizada la inseminación intrauterina, podemos recuperar los embriones por vía quirúrgica o por endoscopía (González-Bulnez, 2005). Estos a su vez pueden ser transferidos a hembras receptoras inmediatamente, o son congelados para su transporte y posterior transferencia. Por lo general estas intervenciones se llevan a cabo bajo anestesia general (Gibbons y Cueto, 1995).
Una vez que se visualizan los ovarios, mediante endoscopía, se pueden determinar el número de ovulaciones (Cuerpos lúteos presentes).
Se realiza una laparotomía media de 5 a 7 cm, y 3 cm por delante de la ubre (Figura 8). Se expone el cuerno uterino (Figura 9) y a nivel de la unión útero tubárica se coloca una sonda, la cual en su extremo dispone de una aguja con punta no traumática y con dos perforaciones laterales y una central.
Figura 8. Incisión para realizar la recuperación de embriones.


Figura 9.
Exposición del cuerno uterino.


Figura 10.
Colocación y fijación de la sonda.



Se fija la sonda en el interior de la luz del cuerno uterino (Figura 10).
En la curvatura mayor del cuerno uterino se realiza una segunda punción (Figuras 11, 12 y 13) para la inyección de 20 cc de una solución tamponada de fosfato (PBS) a 37ºC, la cual producirá una corriente de arrastre hacia el oviducto la cual sale por la sonda, moviendo los embriones hasta el envase de colecta (Figuras 14 y 15).
Figura 11. La flecha señala la segunda punción en la curvatura mayor del cuerno uterino.


Figura 12.
Jeringa con PBS a 37ºC.


Figura 13. Lavado con PBS y recolecta de los embriones.



Figura 14. Se señala la jeringa con PBS y el envase de colecta de embriones.



Figura 15. Colocación de todos los instrumentos para la colecta de embriones.




Una vez recuperados los embriones en un cuerno, se procede de igual manera con el otro. Finalizada la colecta de embriones, se realiza la sutura de los planos quirúrgicos y se administran antibióticos.
Existe otra técnica desarrollada por McKelvey et al. (1986) en ovinos, mediante la cual se realizan tres punciones con trócares en la cavidad abdominal.
La primera punción permite introducir el laparoscopio, la segunda una sonda de tres vías de las cuales una sirve para la entrada del PBS, otra vía para la salida del PBS y la tercera vía para la insuflación del balón. La tercera punción permite la introducción de una pinza no traumática que permite la manipulación del tracto reproductivo. Esta técnica requiere de un buen entrenamiento.
Búsqueda y clasificación de los embriones
Una vez recolectado el lavado uterino, con la ayuda de la lupa (Figura 16), se deben localizar los embriones. A medida que se identifican, son aspirados con una micropipeta (Figura 17) y colocados en una placa de Petri conteniendo PBS enriquecido, con suero al 10% o albúmina bovina (BSA al 4%), protegiéndolos de la luz y a temperatura de laboratorio. Una vez finalizada la búsqueda, se procede a la clasificación de los embriones.
Figura 16. Envase de colecta bajo la lupa. 



Figura 17. Aspiración de embriones mediante micropipetas. 



La clasificación de los embriones se realiza en base a sus aspectos morfológicos. Se deben observar desde distintos ángulos, por la integridad de la membrana pelúcida y la esfericidad de los mismos. El embrión debe tener un desarrollo acorde con el día de colecta; se tolera hasta un máximo de 48 horas de retraso. En el día 6to o 7mo, se deben descartar los embriones de menos de 32 células. Las células deben ser claras y de contorno regular, siendo la opacidad un signo de degeneración.
Una vez escogidos los embriones, estos pueden transferirse a una hembra receptora o bien conservarse por enfriamiento a 4°C por 24h, para transportarlos a corta distancia (Gibbons y Cueto, 1995) o congelarse en nitrógeno líquido para la conservación durante períodos prolongados.
Implicaciones
A pesar de la gran variabilidad de los resultados obtenidos y de lo costosas que pueden resultar estas técnicas, la aplicación de nuevas tecnologías en la reproducción de pequeños rumiantes, están en constante aumento. Estas prácticas son esenciales para la conservación de especies o razas en peligro de extinción y para el comercio internacional de recursos genéticos.
Actualmente las técnicas modernas de reproducción animal permiten que animales de alto valor genético, produzcan más nacimientos que en condiciones naturales y, consecuentemente, permiten la reducción de los costos operativos. Este valor puede incrementarse al mejorar la respuesta ovulatoria a la FSH, así como predeterminando las hembras que responderán al tratamiento hormonal, mediante observación laparoscópica.
No cabe duda que actualmente la transferencia embrionaria es el método más seguro, en el aspecto sanitario, para prevenir las enfermedades exóticas. Esto permite realizar la importación de los diferentes biotipos de alta producción. Estas consideraciones demuestran la importancia que tienen las técnicas de reproducción asistida en pequeños rumiantes, como reaseguro sanitario y como herramienta para el mejoramiento de la producción animal.

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